转录组测序

RNA Sequencing

转录组测序是研究基因表达差异的重要工具，其研究对象为特定细胞在某种功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和。转录组测序技术在检测基因表达水平变化的同时，还能发现稀有转录本，精确地识别可变剪切位点、基因融合，提供最全面的转录组信息。通过高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，帮助科研人员发现生物学现象背后的分子机制。

近年来，华大转录组测序技术已经被广泛运用在各个领域，截止今年12月，华大DNBSEQ™平台RNA测序文章已超1,532篇， 累计影响因子合计8,113.95，平均单篇文章影响因子5.3，多次登上CNS顶级期刊，包含8篇Nature、4篇Cell、1篇Science。2022年新增Nature、Cell各一篇。

在肿瘤相关机制探究、人类的复杂疾病和临床应用到动植物基础机制等领域，转录组测序技术成果不断。以下为2022年华大RNA测序在动植物基础机制研究方向的成果：

动植物基础机制研究篇

2022年，基于RNA测序技术，华大合作客户发表的动植物基础机制研究相关文章已达127篇，包括Nature、Cell Host and Microbe、Nature Ecology & Evolution、Genome Biology、Nature Communications、Journal of Hazardous Materials、Plant Biotechnology Journal在内的IF超6分以上文章达48篇，累计影响因子超495.3分，研究内容涉及动植物生长发育调控机制、植物抗病抗逆机制、植物生物合成机制等。

转录组测序文章-动植物基础机制研究领域上下滑动查看以下是动植物基础机制研究方向的经典文章案例：

经典案例1

Dr. Tom助力研究植物免疫反应机制

文章题目：A surface-receptor-coupled G protein regulates plant immunity through nuclear protein kinases

发表期刊：Cell Host & Microbe

影响因子：31.316

发表单位：中国科学院种子创新研究院、中国农业大学、中国生物科学研究所、北京大学

研究概述：

植物通过细胞表面的免疫受体-模式识别受体（Pattern-recognition receptor, PRR）感知病原微生物来源的保守分子，从而识别病原物入侵，并激活植物天然免疫反应。植物特有的Gα蛋白XLG2与免疫受体偶联，在受体介导的免疫信号调控中发挥重要功能。该研究发现定位于细胞核的MUT9样激酶（MLKs）是XLG2的下游效应因子。MLKs以激酶活性依赖的方式对植物免疫力进行负向调节，XLG2可能通过抑制MLK促进防御基因的表达和植物免疫。

研究成果：

XLG蛋白在C端具有Gα结构域，N端延伸具有核定位序列（NLS）。XLG2无论在免疫是否激活的状态下都可以调节植物的免疫。为了研究其表达变化，研究团队用flg22处理Nicotiana benthamiana原生质体，在未处理的情况下，XLG2-GFP定位于质膜和细胞核，经过处理后，XLG2-GFP在细胞核当中的积累大大增加。在拟南芥原生质体和构建的转基因植物也都具有类似的现象，说明XLG2在flg22的刺激下在细胞核当中积累。敲除NLS的实验结果表明该过程紧密依赖于NLS。

接下来，该研究在分别在XLG2/3突变体构建了XLG2ΔNLS-FLAG和野生型的XLG-FLAG来测试NLS在植物免疫当中的作用，并检测不同的突变体对于Pst的抗性。发现XLG2/3突变体相比于野生型WT Col-0和XLG-FLAG，细菌在叶片更大量生长。XLG2ΔNLS-FLAG也有高水平的Pst生长。因此，XLG2的核定位对触发抗菌免疫至关重要。

Flg22会诱导XLG2在Ser141、Ser148、Ser150和Ser151磷酸化，磷酸化过程也对抗Pst的免疫至关重要。该研究进一步探索磷酸化过程对flg22诱导的核定位过程的作用。在原生质体构建了野生型，磷酸化缺失，和磷酸化的XLG2-FLAG。在非磷酸化的情况下flg22未能诱导XLG2-FLAG在核中的积累，表明了磷酸化对于XLG2核定位的重要性。后续进一步的抗Pst实验也证实了该结论。

为了确认XLG2调控的下游因子，研究团队通过质谱分析，确定了同源激酶MLK。利用共免疫沉降技术，发现MLK2-FLAG与XLG2-HA相互作用明显。在N. benthamiana原生质体中，MLK4-GFP和MLK2-GFP都定位在细胞核当中。XLG2-GFP和MLK-mCherry融合表达蛋白也共定位在细胞核当中。在拟南芥当中进一步实验也验证了该结果，并且MLK4-XLG2的相互作用因flg22的处理而增强。

确认MLK后，研究团队进一步研究了MLKs在植物免疫当中的作用，利用CRISPR-Cas9产生了不同的MLK突变体，并且在Pst接种后，检测FPRK1和BIP3的表达（二者受到XLG的调控），结果显示mlk1/2/3和mlk1/3/4两种三重突变体具有高的FPRK1和BIP3表达。表明了MLKs在植物抗病原体当中具有负向调节的作用，其中MLK4的作用最为显著。

为了确定MLK和XLG是否通过相同的通路调节植物免疫，再次构建了MLK和XLG突变体mlk1/2/3 xlg2/3。MLK XLG五重突变体对于flg22的敏感性明显降低，同样，对于Pst的敏感性也降低。该研究进一步对Col-0、xlg2、MLK4-OE和mlk1/3/4在Pst培养下的转录组分析显示，和野生型相比，在植物免疫响应相关的差异基因中，xlg2和MLK4-OE大多是下调的。并且XLG和MLK差异基因重叠多，这些基因表达变化是被共同调控的。表明二者是在同一通路调控植物免疫。进一步研究发现，XLG通过抑制MLK的激酶活性调控植物免疫。

图1 XLG2介导的植物免疫调节机制上下滑动查看本研究发现了一个以前从未探索过的植物免疫调节机制，在植物当中flg22和其他免疫原性物质可以快速的通过依赖于XLG2 NLS和磷酸化过程增强XLG2的核定位；并且确定了MLK2是XLG的下游效应因子，共同调节免疫，将细胞表面的免疫受体和细胞核当中防御基因调节联系起来，对于提高植物抗病性具有重要指导意义。

经典案例2

微量转录组助力研究蚂蚁种姓分化

文章题目：Canalized gene expression during development mediates caste differentiation in ants

发表期刊：Nature Ecology & Evolution

影响因子：19.1

发表单位：Villum生物多样性基因组学中心、哥本哈根大学、中国科学院昆明动物研究所、广西大学农学院、中国科学院大学昆明生命科学学院等

研究概述：

该研究以法老蚁（Monomorium pharaonic）和切叶蚁（Acromyrmex echinatior）为模式物种，对不同发育阶段的蚂蚁个体进行微量RNA测序，分析蚂蚁个体发育分化的表达模式。该研究使用一种新算法在幼虫表达形态差异之前预测种姓表型，同时关注了幼虫-蛹的转变，量化种姓特定的渠化效应及其潜在途径，鉴定出调节种姓表型渠化的关键基因。

研究成果：

由转录组数据构建蚂蚁的发育轨迹网络，主要按发育阶段对个体进行聚类，也按种姓表型对个体进行聚类。两种蚂蚁在整个发育阶段之间有67-81%的相似性，说明两种蚂蚁所属的Myrmicinae具有较大的保守性。

在M. pharaonis和A. echinatior的二龄和三龄幼虫之前，雌蚁和工蚁个体之间的形态学差异无法分别检测到。为了在缺乏形态学标记的早期阶段识别个体种姓表型，研究团队开发了向后进步算法（backward progressives algorithm ，BPA)），该算法可以推断个体属于某个种姓的可能性。使用来自果蝇的胚胎性别分化数据验证了BPA，并确认了BPA在具有已知种姓身份的M. pharaonis和A. echinatior幼虫样本中的准确性。

接下来，该研究关注全基因组表达的整体渠化程度，将转录组水平的渠化定义为单个转录组从单峰（多能）分布开始并逐渐变为双峰（表型定型）分布的统计趋势，随着发育的进行，峰差异越来越明显。该文章定义了发育潜力( Δ )，Δ值介于-1和1之间，正值表示目标个体的发育偏向雌蚁，负值表示偏向工蚁。两种蚂蚁种姓之间的Δ绝对值稳定增加，而种姓内Δ值的方差随着发育的进行逐渐减，在此过程中，雌蚁在转录组水平上渠化程度总是强于工蚁。

当蛹变态开始时，全基因组转录组渠化特征被放大到第三龄之后，这是所有全变态昆虫的关键阶段。为了了解种姓分化的整个上游调节，研究者使用广义线性模型来探究幼虫体重的影响因素，确定了65个保守基因与两种蚂蚁的幼虫分化相关。这些早期种姓差异表达基因（DEG）显著富集在参与脂肪酸和激素代谢的基因类型。此外，多个幼虫等级DEG与保幼激素（Juvenile hormone，JH）通路有关，保幼激素通路是昆虫幼虫生长和蜕皮的关键调节因子。另外，研究者还发现许多参与JH和蜕皮激素代谢的基因在幼虫从三龄过渡到预蛹阶段时表现出体长特异性和种姓特异性表达。以上结果证实了JH对种姓分化的重要作用。

为了解在蛹阶段的种姓分化过程中哪些基因被渠化，作者团队开发了基因特异性渠化评分，确定了1,140和2,478个基因分别在M. pharaonis（雌蚁 vs工蚁）和A. echinatior（雌蚁 vs工蚁）中渠化表达。在这些渠化基因中，457个在两个物种中表现出相同的种姓偏好方向，明显高于背景预期的88个，表明基因水平的渠化在进化上是保守的。

M. pharaonis中具有雌性偏向渠化的基因是膜翅目特异性的，并且编码一种蛋白质，该蛋白质包含预测的信号肽和富含亮氨酸的重复结构域。该基因的种姓偏向表达始于二龄幼虫，并随着发育的进行而扩大。在成年雌性动物中，该基因主要在卵巢中表达，其表达主要限于卵子发生所必需的卵巢卵泡细胞，将其命名为Freja。研究团队通过RNAi敲低研究了晚三龄雌性幼虫中Freja的功能。相对于GFP-RNAi对照组，Freja -RNAi治疗组的成虫身体和头部尺寸显著减小和更高频率的异常翅膀形态。因此，操纵Freja的表达扰乱了正常的发育通道。

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作为社会性昆虫， 蚂蚁群体有着明确的社会分工和高度有序的社会组织，被冠以“超有机体”的称号，该研究发现了种姓分化的超级有机体群落是由更高级别的适应形成的，可以预测繁殖的整个生命周期。

在此过程中，种姓表型的互补发展需要通过渠化基因的表达变化进行协调和缓冲，类似于后生动物体发育过程中细胞分化的动态调节。另外，当相关遗传变异出现并且种姓表型定向变化的选择压力足够大时，可以改变渠化的发展途径，类似于在多细胞生物适应性辐射中细胞系分化。以上结果都揭示了蚂蚁群体和多细胞生物在发育和演化上的相似之处，为将蚁群视为超有机体的理论找到了证据支持。

经典案例3

phasiRNAs助力水稻低温育性调控机制

文章题目：Mobile ARGONAUTE 1d binds 22-nt miRNAs to generate phasiRNAs important for low-temperature male fertility in rice

发表期刊：Science China Life Sciences

影响因子：10.372

发表单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室

研究概述：

研究团队鉴定了一种低温诱导的水稻Argonaute（AGO）蛋白OsAGO1d，该蛋白负责产生phasiRNAs并在低温下保持雄性可育性，并且，研究团队试验揭示了OsAGO1d可以作为一种移动信号从花药壁细胞移动到花粉母细胞，通过结合22-nt miRNA介导phasiRNA的合成以维持水稻低温育性。

研究成果：

低温可限制作物的分布和产量，在孕穗期，低温导致水稻减产和不育。植物对环境温度极为敏感，能产生大量的21和24nt大小的阶段性小干扰RNA（PhasiRNA）。phasiRNA生物生成因子的缺陷会导致几种植物物种的雄性不育，敲除水稻miR2118后可引起花药壁发育异常，敲除水稻和玉米MEL1引起减数分裂异常和雄性不育。

phasiRNA可分为21nt/24nt-两种类型，并有着极大差别：功能上，21-nt phasiRNAs以靶标清除模式发挥作用，而24-nt phasiRNAs有助于CHH位点的DNA甲基化；从时间上看，21-nt phasiRNAs在减数分裂前阶段更为丰富，而24-nt phasiRNAs在减数分裂和减数分裂后阶段更为丰富；在空间上，PHAS前体、miR2275和24-nt phasiRNAs只在花药中表达，特别是在减数分裂细胞中，miR2118在花药壁细胞中特异表达；但成熟的21-nt phasiRNAs在减数细胞中积累。

该研究发现，水稻OsAGO1d受低温诱导表达，OsAGO1d敲除突变株在低温下绒毡层降解延迟，导致雄性不育。通过RNA免疫共沉淀实验，研究者发现OsAGO1d主要结合带有5′U的21-nt phasiRNA以及miR2118和miR2275家族成员。通过小RNA测序，研究者发现OsAGO1d介导了近千个PHAS位点phasiRNA的产生。而RNA原位杂交结果显示OsAGO1d主要在花药壁细胞中转录，免疫荧光与免疫金标的结果则显示OsAGO1d蛋白更多的在花粉母细胞中积累，表明OsAGO1d蛋白质可以从花药壁细胞移动到花粉母细胞中。为了探究OsAGO1d的移动对phasiRNA合成的重要作用，研究人员通过分析依赖于OsAGO1d的phasiRNA组织表达及在花粉母细胞中的分布比例，揭示OsAGO1d在花药壁细胞中结合miR2118从而负责21-nt phasiRNA的产生，而移动到花粉母细胞中主要结合miR2275产生24-nt的phasiRNA。

图2 OsAGO1d调控水稻低温育性示意图：在花药的不同组织负责不同长度phasiRNA合成上下滑动查看单子叶植物生殖细胞中产生大量21-nt和24-nt phasiRNA，和动物中piRNA类似参与雄配子发育，该研究解析了OsAGO1d介导phasiRNA代谢在低温育性调控的重要作用，其可移动的特性精准调控了不同长度phasiRNA的时空分布，为花药发育过程中花药壁与花粉母细胞之间信号交流机制提供了新的理论基础。

年终总结

RNA测序技术已经广泛应用，从肿瘤相关机制探究、人类的复杂疾病和临床应用到动植物基础机制研究，都可以结合RNA测序技术进行。

华大RNA测序产品拥有丰富经验及高质量产出，RNA测序产品 “2022年终钜惠+感恩回馈”活动倒计时3天，期待您的参与，让华大助您一臂之力。

2022年已接近尾声，感恩信赖！2023年，期待自主平台为广大科研工作者持续助力，共创学术佳绩！

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责任编辑：kj005