溶液外观对注射用的原料来说是必检项目，其通常包括液体的透明度、浊度和颜色。在生物制剂制造过程中，由于培养基及金属工艺设备的接触，使得色素存在于蛋白质中间体和最终样品原液中，这在高浓度蛋白溶液中尤为显著。

蛋白溶液的外观在产品放行检测时是一个重要的质量参数。《欧洲药典》对人用单克隆抗体颜色做出了要求，即人用单克隆抗体的液体制剂是“透明或略带乳白色，无色或略带颜色的液体”[1]。这也是国际人用药品注册技术协调会(ICH) Q6B放行规范中规定的检测项。颜色异常意味着产品可能被污染或已降解，所以色素的控制和去除是蛋白生产过程中非常重要的环节。提前了解色素的控制和去除方法对于新药或仿制药的质量标准起草和申报都非常有帮助。

色素的来源

影响蛋白溶液颜色且难以去除的色素主要是由培养基组分在培养和收获过程中与蛋白分子结合或导致蛋白分子变性时产生的。对颜色影响最大的是维生素B和铁离子，比如哺乳动物细胞培养基中的常添加的CN-B12在光照条件下转化为OH-B12之后与抗体分子结合导致粉色[2]；铁离子浓度会增加蛋白药物原液的颜色和酸性变异体。

铁离子不会直接引起蛋白原液的变化，会因芬顿反应产生活性氧（ROS），使蛋白质发生氧化，导致蛋白质中的色氨酸氧化成N-甲酰犬尿氨酸(浅黄色)和犬尿氨酸(棕黄色)[3,5]。

细胞培养过程中产生的几种高级糖化终产物(AGE)是有颜色(黄褐色)和荧光的。AGE的结构及其形成途径复杂多样，但都源于还原糖或碳水化合物氧化降解的二羰基副产物与蛋白质赖氨酸或精氨酸的氨基侧链反应[3]。

毕赤酵母诱导中后期，AOX1醇氧化酶释放进入发酵液，结合黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 辅因子形成八聚物导致绿色[4]。

另外，天然互作蛋白以及小分子色素等，也可能会引入颜色。

蛋白溶液颜色的控制

在蛋白生产过程中，细胞株构建、上游培养、层析纯化这三个阶段都能对色素进行有效的控制和去除。尤其在纯化阶段，层析介质可以有效去除样品中的多种色素。

细胞株构建阶段

不同的细胞株对铁离子和维生素B12的吸收和需求量有所不同，如果选择对铁离子和维生素B12消耗速率快或含量要求低的细胞株，使其培养液中的铁离子和维生素B12含量降低，产生异常颜色的概率会降低。

上游培养阶段

适当优化培养基的组分，比如抗体生产中可以适当调整培养基中的高氧化性组分（如铁离子）和光敏感性成分（如B族维生素等）的含量。

在细胞培养工艺开发中，通过优化金属离子或者其它添加剂的含量，可能会导致蛋白显色，建议尝试不同类型的培养基，适当减少这些成分的用量，并通过筛选高产细胞株或长期传代驯化，保证产量。

层析纯化阶段

色素的种类特别多，大分子、小分子的，带正、负电荷的，疏水、亲水的等。层析纯化适用于去除一些与蛋白质不结合或者非共价结合的色素去除，对于一些与蛋白共价结合的色素（如OH-B12与半胱氨酸残基的结合），则需要优化培养条件，在上游培养阶段进行控制。如果不清楚溶液中色素的性质，可以尝试不同的层析方法。

• 亲和层析

亲和层析多为蛋白纯化捕获阶段，通过优化缓冲液体系以破坏色素与填料之间的离子型吸附及非特异性吸附，在对蛋白进行富集的同时可有效去除色素。

• 离子交换层析

中性条件下多数色素带负电荷，阴离子流穿模式时色素与填料结合，通过高盐或碱液洗脱。或蛋白结合阳离子填料，色素流穿。该阶段的重点在于溶液的pH值与离子强度，找到合适的上样条件是去除色素的关键。

• 疏水作用层析

色素也具有一定的疏水性质，因此可以利用色素与目的蛋白表面疏水性的差异，通过优化填料的种类、盐的类型和浓度、选择不同的盐浓度梯度洗脱的方式来去除色素。

• 凝胶过滤层析

如果色素与目的蛋白分子量上有明显差异，可使用凝胶过滤进行去除，例如通过脱盐柱进行缓冲液置换及精纯阶段高分辨分子筛除杂时，色素在一定程度上可被去除或被吸附。

案例分享：动物源体外分泌酶中色素的去除

本案例使用博格隆Diamond MMC Mustang复合模式层析介质通过DoE方法开发出的动物源体外分泌酶的纯化工艺，可以很好地将料液中的黄色色素去除掉。从下图中可以明显看出，洗脱液基本接近无色，色素去除效果很好。

左：原样；中：清洗液；右：洗脱液

博格隆Diamond MMC Mustang是一款高刚性的弱阳离子+疏水的复合模式层析介质，由于兼具离子、疏水、氢键、范德华力等多种作用力，使其对多种类型的色素都有较好的去除效果。

层析介质上色素的去除

色素性质复杂，可根据层析填料的耐受情况制定CIP方案。NaOH是最常用的清洁试剂。除此之外，高盐、有机试剂（20%乙醇或30%异丙醇）、尿素、盐酸胍或酸也是常见的清洗方案。也可通过混合试剂或其他针对性清洗方法对层析填料进行处理，如已知色素种类，可根据色素的性质采用特定的方法进行清洗。

铁离子残留带来的黄褐色去除

黄褐色主要源于铁离子与NaOH反应生成的氢氧化铁沉淀，可以尝试使用酸进行清洗，例如使用0.5M磷酸静态处理10~15min。处理时间不宜过长，时间过长可能会导致铁离子重新结合[5]。

维生素B12引起的粉色去除

可以使用组氨酸或咪唑等电子供体取代OH-B12中的OH自由基，例如使用0.3M组氨酸+0.5M NaCl，pH4.0的缓冲液处理5~10CV。

疏水作用力结合的色素去除

使用高浓度的碱溶液破坏蛋白结构，破坏疏水作用力，例如使用0.5~1M NaOH处理3~5CV。

脂类色素

根据相似相溶原理可以用0.5M 非离子去污剂、70%乙醇、30%异丙醇处理3~5CV。

沉积的顽固色素

可以采用多种试剂混合进行处理，例如使用0.5M醋酸+8M尿素+1~2M NaCl或1M NaOH+2M NaCl处理5~10CV。在可以耐受有机溶剂时，还可使用1M NaOH+30%异丙醇的方式进行清洗。

随着介质使用次数的增加，积累的色素仍可能会导致层析填料外观颜色变深、载量下降，严重时柱内填料塌陷、板结，影响层析填料性能与寿命，必要时可以去掉部分色素污染严重的层析填料。

总结

色素的种类多样，虽然层析纯化是去除色素最有效的方法之一，但是层析介质的性能也受色素影响，因此对料液预处理阶段的过滤与澄清，可以很大程度上缓解后续纯化的压力、延长层析填料的使用寿命。

参考资料

[1] European Pharmacopoeia, Council of Europe, Strasbourg,France, Edition 7.5; 2012.

[2] Kenneth M Prentice, et al. Hydroxocobalamin association during cell culture results in pink therapeutic proteins [J]. mAbs, 5:6, 974-981, 2013.

[3] Margaret Butko, et al. Recombinant Antibody Color Resulting from Advanced Glycation End Product Modifications [J]. Analytical Chemistry, 86(19): 9816-9823, 2014.

[4] L. M. Damasceno, et al. An optimized fermentation process for high-level production of a single-chain Fv antibody fragment in Pichia pastoris [J]. Protein Expression and Purification, 37:18-26, 2004.

[5] 翁志兵,王鹏红,赵力,等.层析填料中顽固色素去除的新方法研究[J].食品与生物技术学报,2022,41(02):106-111.

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