Hans Clevers科研团队又有新发现!他们利用多重碱基基因编辑方法，在成体干细胞衍生的类器官中一步生成了肿瘤类器官模型，让构建类器官更快速、更灵活。相关研究论文已发表在《Nature communications》(影响因子IF=16.6)。科学家希望以此来建立一个具有复杂基因型的突变类器官库。这种类器官+基因编辑的研究方式，将为探索各类癌症的发生、发展和治疗提供新策略。

2009年，荷兰科学家Hans Clevers教授及其科研团队利用小鼠LGR5+小肠干细胞成功培养出世界上第一个真正的类器官——微型肠道类器官，由此开启了类器官研究“新纪元”。

在科学家的先锋探索和类器官技术的持续精进下，更新型、更复杂的类器官研究模型不断涌现，在新药研发、精准治疗、基因编辑、疾病模型等领域显示出更强大、更广泛的应用潜能。

近期，Hans Clevers团队在《Nature communications》发表力作，表明通过多重碱基编辑方法可以在成体干细胞衍生的类器官中一步生成肿瘤类器官模型!他们希望通过这种策略来建立一个具有复杂基因型的突变类器官库，以便更好地研究人类癌症的发生机制。

△ 通过多重碱基编辑器在成体干细胞衍生的类器官中一步生成肿瘤类器官，为探索各种类型的肿瘤生病、发展和治疗提供了新的机会。

同时，这也为创建实体瘤的体外类器官模型大开方便之门，解决了以往肿瘤类器官模型构建方法的复杂性和耗时性问题，为探索各类癌症的发病、发展和治疗提供新策略。

01

多重碱基编辑法

一步生成肿瘤类器官

成体干细胞(ASCs)衍生类器官(adult stem cell-derived organoids)大多数来源于上皮组织，并正在成为弥合2D细胞系和体内动物模型之间差距的重要工具。凭借其3D结构和细胞异质性特征，类器官与起源组织非常相似，对研究健康和患病人体组织而言，是极具吸引力的研究模型系统。

得益于类器官技术发展，肿瘤类器官也进入研究新阶段。尤其是患者来源的肿瘤类器官，作为研究体内肿瘤的优秀体外模型，比传统的2D细胞培养技术有显著优势。此外，患者来源的肿瘤类器官模型在测试药物疗效和确定患者个性化治疗等方面也显示出更多应用潜能。

近期，类器官领域又传出研究新发现!

被认为是类器官“鼻祖”的Hans Clevers教授及其研究团队，在《Nature Communications》发表学术论文[1]表示，通过多重碱基编辑技术，同时与多种癌症相关的基因突变引入成体干细胞来源的类器官，成功解决了以往肿瘤类器官模型构建方法的复杂性和耗时性，有效制造了模拟肝癌、结直肠癌和子宫内膜癌的肿瘤类器官。

此前有研究证明，CRISPR-Cas9介导的基因编辑可以应用于类器官来研究肿瘤发生，其优化已经产生了有望用于突变修复和疾病建模的碱基编辑器。在新的论文中，研究团队展示了多重碱基编辑(base editing multiplexing)在人类ASC衍生类器官中生成复杂肿瘤模型的应用。

碱基编辑 (Base Editing，BE)是由刘如谦 (David Liu) 等人开发并逐步扩展、完善的一种新型基因编辑技术，碱基编辑能够在特定位点以高精度和高效率对单个碱基对进行编辑，且不会像CRISPR-Cas9那样依赖于DNA双链断裂 (DSB)，因此被认为具有更高的安全性。

Hans Clevers研究团队发现胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)和腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)都可以模拟肝细胞癌中最常见的基因CTNNB1突变，并且SpCas9的进化变体可以增加碱基编辑器在类器官中的靶向空间。

△ 使用常规和进化的 CBE 和 ABE 在肝细胞类器官中引入 CTNNB1 的致癌激活突变。

接下来，团队用CBE介导的CRISPR-STOP(SHERLOCK Testing in One Pot)技术(该技术直接使用裂解后的样本)，在子宫内膜类器官中靶向导入子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)相关基因的终止密码子，证明了该方法能用于类器官模拟子宫内膜的肿瘤发生。

通过结合不同的CBEs，建立了EC发生的类器官模型。采用Cas9同源物，同时引入癌基因激活和肿瘤抑制失活突变，促进了肿瘤模型的形成。目前对EC的认识尚浅，且缺少相关的人类模型来研究肿瘤的早期发生。而通过基因编辑生成的EC肿瘤类器官，一定程度上缓解了研究模型的缺乏，为深入研究该病的疾病发展，治疗对策提供了新见解。

△ CBE CRISPR-STOP有效地在子宫内膜类器官中引入PTEN的无义突变。

研究团队还进行了多重碱基编辑，他们将5个癌症基因的sgRNA同时转染到野生型结肠类器官，用pCMV-AncBE4max靶向APCQ1406*、PIK3CAE545K、SMAD4R361H、TP53W53*、KRASG12，可以更好地建立结直肠类器官模型。通过分析碱基编辑器的脱靶效应，与序列突变诱导相比，多重编辑所导致的脱靶率显著减少。

最终，通过在肝细胞、子宫内膜和结肠类器官中的研究实验，展示了多重碱基编辑基因组工程策略在建立人类肿瘤3D模型方面的多功能性和高效性。

该研究通过揭示同时结合不同的碱基编辑工具(CBE和ABE)、Cas9同源物或改良的Cas9变体的多碱基编辑法在构建肿瘤类器官的潜在可能，进一步拓展了碱基编辑在肿瘤类器官领域中的应用。多重碱基编辑法或可作为一种从各种组织中构建肿瘤模型的通用工具，这种策略有望延伸至人类ASC衍生的所有上皮组织实体瘤类器官，能更好地帮助我们理解肿瘤的发生，为探索各种类型肿瘤的发病、发展和治疗方案提供了新策略。

02

类器官+基因编辑

冲破再生医学技术壁垒

基因编辑，对于理解基本生物学过程非常重要，得益于近年来基因编辑技术的迅猛发展，促成了对生物学和再生医学的全新认知。

与此同时，通过干细胞培养衍生类器官，模拟人体器官(或组织)，为生物学研究提供了良好的体外研究模型，二者交叉碰撞，有望在再生医学领域研究激起更多涟漪。

对于新颖、易操作且用途广泛的编辑技术——CRISPR-Cas9“基因魔剪”系统，与类器官技术强强联合，提供了崭新的研究平台和范式，目前已在肝癌、神经发育障碍、自闭症等疾病领域有不俗的研究成果。

类器官+CRISPR，揭示罕见肝癌转分化机制

由于研究模型的匮乏，一些难治性疾病在中后期的治疗手段相对有限，成为很多疾病治疗的难点和研究治疗方案的痛点。

纤维板层癌(FLC)是一种罕见的肝癌，存活率极低，目前尚无有效的治疗方式。Hans Clevers研究团队通过对人类肝细胞类器官进行CRISPR基因改造，为破解该类疾病治疗带来新策略。[2]

△ 存在导管细胞(红色)和癌症干细胞(绿色)迹象的人类微型肝脏

他们通过在类器官中重建突变，来重现发生在FLC患者身上的肿瘤的多种特征，尤其当引入一组含有PKA基因之一PRKAR2A的突变，且还包含另一个名为BAP1的基因时，类器官呈现出侵袭性癌症的典型特征。

通过这种经过CRISPR基因编辑的类器官模型，发现了肝细胞是可能的细胞来源。这极大地促进了对FLC的理解，并为深入研究这种罕见癌症铺平了道路。

类器官+CRISPR，揭示影响神经发育疾病致病基因

在神经发育障碍研究方面，类器官协同基因编辑技术，正在探究以往未曾涉猎的前沿领域。

来自斯坦福大学的科研团队，利用升级的大脑类器官组装体模型与先进的CRISPR基因筛选技术，系统揭示了425个神经发育障碍相关基因在抑制性神经元发育中的作用，表明神经发育障碍相关基因映射到人脑发育，并揭示疾病机制的能力。[3]

△ 对神经发育性疾病相关基因的CRISPR筛选揭示了调控人类抑制性神经元生成与迁移的基因。

研究者表示：由iPSC诱导分化出的人脑类器官及其组装体为我们提供了具有一定功能的人类脑组织，解决了长期以来无法使用人类神经细胞研究人类神经系统疾病的问题。

CRISPR+类器官+单细胞测序，揭秘自闭症发育缺陷

人类大脑是一个复杂又精密的细胞网络“集合体”。在动物模型研究神经发育障碍类疾病十分受限的条件下，科学家们试图利用人脑类器官模型来模拟胎儿发育期的大脑状态，以寻求更广泛的自闭症干预措施。

为了打开自闭症研究的“黑匣子”，科学家们开发了一种全新的筛选平台——CHOOSE 系统(CRISPR-human organoids-scRNA-seq)，充分结合类器官与CRISPR基因编辑、单细胞基因测序等前沿技术的优势。[4]

△ 左侧：CHOOSE系统的共聚焦成像，红色的为携带基因突变的细胞;右侧：不同颜色的马赛克图案代表单个细胞，每个细胞携带一个自闭症相关基因突变(图片来源：Knoblich实验室)

利用这一创新研究模型，实现了高通量、高精度、高稳健地在人类大脑类器官的单细胞水平上全面测试形成自闭症发育缺陷的基因突变及细胞类型，有望为研究最复杂的脑类疾病带来新希望。这也被认为是标志着人类组织中复杂、高效和便捷的基因筛选时代的开始。

随着类器官技术逐渐进入跨领域、跨学科研究的新阶段，尤其结合CRISPR和基因测序等前沿科技,有望激发在疾病模型、通路分析等场景的应用潜能，将突破过往疾病研究和治疗手段的模型匮乏，通过生物样本库的逐步完善，将为药物敏感性筛选、复杂疾病治疗、发病机制研究、治愈方案创新等提供新策略。

Write in the last

写在最后

基因编辑技术，尤其是CRISPR技术，赋予了人类精确操控DNA序列的能力，为生物医学领域提供了从根本上治疗遗传疾病的新机遇。基因编辑与类器官两种技术相辅相成，在体外构建类器官疾病模型，并利用基因编辑技术修正致病基因，将会极大促进干细胞研究和类器官研究的临床前转化和个体化医疗的发展。

参考文献：

[1] Geurts, M.H,Gandhi, S., Boretto, M.G. et al. One-step generation of tumor models by base editor multiplexing in adult stem cell-derived organoids.Nature Communications 14,4998 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-

[2] Rüland, L., et al. Organoid models of fibrolamellar carcinoma mutations reveal hepatocyte transdifferentiation through cooperative BAP1 and PRKAR2A loss. Nature Communications.(2023). doi.org/10.1038/s41467-023-37951-6.

[3] Meng, X., Yao, D., Imaizumi, K. et al. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06564-w

[4] Chong Li, Jonas Simon Fleck,et,al,Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism,Nature(2023)

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