导语：常规的化学蛋白质组学大多回答"药物结合了哪个蛋白"；而对于共价小分子与天然产物而言，真正决定其活性与选择性的，往往是结合在蛋白的哪一个氨基酸位点上。isoTOP-ABPP（isotopic Tandem Orthogonal Proteolysis–Activity-Based Protein Profiling，基于同位素标记串联正交酶水解的活性蛋白质分析技术）正是为把观测精度推进到"位点级"而发展起来的技术。本篇从技术发明、技术原理、技术特点、应用场景到代表性案例，做一次完整梳理。

一、isoTOP-ABPP技术原理

2010年，来自斯克利普斯研究所的Benjamin F. Cravatt研究团队于《Nature》发表了一项题为“Quantitative reactivity profiling predicts functional cysteines in proteomes”的研究。该研究在ABPP技术的基础上开发了一种竞争性活性导向蛋白质分析方法——基于同位素标记串联正交酶水解的活性蛋白质分析技术（isotopic Tandem Orthogonal Protease-activity-based Protein Profiling，isoTOP-ABPP）。首先被应用于在全蛋白质组范围内定量分析半胱氨酸的反应活性。

在蛋白质组中，半胱氨酸是亲核性最强的氨基酸之一。其侧链巯基具有较高的亲核性与氧化还原敏感性，既可作为多种酶的催化亲核试剂，也参与变构调控、金属配位与氧化修饰。正因这种高反应性，半胱氨酸成为共价药物设计中常见的结合位点，也使"在细胞层面定位小分子结合的半胱氨酸"成为靶点发现与机制研究中的关键环节。

isoTOP-ABPP 的技术链条包括四个环节：

首先，利用炔基化碘乙酰胺探针（IA-Alkyne）通过 S_N2 反应与活性半胱氨酸残基共价结合；随后，通过点击化学连接叠氮基富集标签（Azide-TEV-Biotin），利用生物素实现链霉亲和素磁珠富集，并通过 TEV 蛋白酶和胰蛋白酶串联酶切释放标记肽段，实现结合位点鉴定。最后，实验组与对照组分别引入轻（Light）、重（Heavy）同位素标签，按 1∶1 混合后进行 LC-MS/MS 分析，通过轻/重信号比值（Ratio）定量比较不同组间半胱氨酸位点的标记程度变化。

与常规蛋白质组学研究相比，isoTOP-ABPP 的差异并不在于"检测到哪些蛋白"，而在于将目标定位于活性氨基酸位点层面：传统定量蛋白质组学通常比较蛋白丰度的变化，而 isoTOP-ABPP 关注的是一群功能特异性的探针在何处、以何种程度完成了化学标记。正因如此，它能够在活细胞或天然裂解体系中直接反映"化合物与蛋白之间真实发生了化学作用"的事实，而不是仅凭丰度或表型关联去推测靶点。

在此基础上，该团队在2013年于《Nature Methods》发表了题为“A chemoproteomic platform to quantitatively map targets of lipid-derived electrophiles”的另一研究。在该研究中，团队利用“竞争性结合”这一概念，通过对比分析小分子化合物与探针作用后标记信号的改变，来鉴定小分子在细胞中与靶蛋白结合的具体半胱氨酸位点。

不同于之前技术中化合物对蛋白质的直接标记，在该研究中，isoTOP-ABPP先将待研究的小分子化合物处理实验组样品，用等量的对照溶剂处理对照组样品。随后在两组中分别加入IA-Alkyne探针进行竞争标记。最后，通过点击化学反应及质谱分析，比较实验组与对照组样品，其中标记信号显著降低的位点即是小分子化合物的潜在结合位点。

二、技术特点

• 蛋白质组范围内筛选潜在靶点：可在复杂蛋白质组中平行分析多个蛋白及其半胱氨酸位点，减少仅针对单一候选蛋白开展验证的局限。

• 结合位点定位至氨基酸水平：不仅能够筛选潜在靶蛋白，还可鉴定受到小分子竞争影响的具体半胱氨酸残基，为后续结合位点研究提供线索。

• 定量比较，评估位点竞争程度：通过轻、重同位素标签与 LC-MS/MS 定量比较实验组和对照组的探针标记信号，评估不同位点的标记变化。

• 无需对待测小分子进行探针修饰：采用未修饰的小分子进行预处理，再通过 IA-Alkyne 探针竞争标记，避免因直接修饰待测化合物而改变其结构。

• 有助于发现潜在的共价作用位点：适用于研究能够与半胱氨酸或赖氨酸等发生共价反应的小分子，可为共价药物靶点发现及结合位点分析提供实验依据。

三、isoTOP ABPP的应用场景

• 其一，药物靶点发现：以化合物为竞争小分子，寻找其在蛋白组中直接占据的位点。

• 其二，作用位点定位：在已知靶蛋白的前提下，进一步明确小分子结合的具体半胱氨酸，为理解共价机制提供结构线索。

• 其三，开发新的共价药物：鉴定高反应性、高活性的半胱氨酸位点，为理解药物机制和开发新的共价药物提供数据支持。

四、典型案例解读：isoTOP-ABPP技术解析穿心莲内酯共价靶向 Ptges3 Cys58

特发性肺纤维化（IPF）是一种以慢性炎症与成纤维细胞活化为特征的进行性、致死性肺病，现有治疗选择有限。天然二萜内酯穿心莲内酯（andrographolide, AP）具有抗炎与抗纤维化活性，但其直接分子靶点与确切机制此前尚不清晰。中国中医科学院中药研究所团队在Journal of Advanced Research发表了研究文献“Andrographolide attenuates pulmonary fibrosis by covalently targeting Ptges3 and disrupting the Ptges3-Hsp90-NF-κB axis”。

该研究以巨噬细胞为对象，采用isoTOP-ABPP技术鉴定其共价靶点，并通过 siRNA 敲低、酶活性测定、分子对接与生物物理分析进行功能验证；同时利用博来霉素诱导的肺纤维化模型与 LPS 诱导的急性肺损伤模型，结合肺组织特异性 Ptges3 敲低，评估其疗效与靶点依赖性。

关键结果显示：穿心莲内酯共价结合于前列腺素 E 合成酶 3（prostaglandin E synthase 3, Ptges3，亦称 p23）的 Cys58 位点，该位点位于一个变构区域，区别于 Ptges3 的催化区与 Hsp90 结合区。结合后，Ptges3 的酶活性受到抑制、前列腺素 E₂（PGE₂）生成减少，同时 Ptges3-Hsp90 伴侣复合物被破坏，进而抑制 NF-κB 信号通路；遗传学层面的 Ptges3 敲低可显著削弱穿心莲内酯在体外与体内的抗炎、抗纤维化效应，从因果角度支持 Ptges3 是其功能靶点。该研究确立了 Ptges3 作为穿心莲内酯的关键功能靶点，并提出"共价抑制 Ptges3 + 破坏 Ptges3-Hsp90-NF-κB 轴"的双重机制，提示 Ptges3 可作为 IPF 的可成药新靶点。

从方法学角度看，Cys58 位于变构区域而非催化中心，这类"变构共价位点"往往难以通过常规活性筛选发现，而位点级的化学蛋白质组学方法恰好能够提供这一层面的信息，也说明共价药物的作用方式未必局限于催化位点。

（参考文献：Zhang Q, Zhang Y, Wang C, et al. Andrographolide attenuates pulmonary fibrosis by covalently targeting Ptges3 and disrupting the Ptges3-Hsp90-NF-κB axis. Journal of Advanced Research, 2026. doi:10.1016/j.jare.2026.05.038）

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