转录组测序RNA Sequencing

转录组测序是研究基因表达差异的重要工具，可以帮助科研人员发现生物学现象背后的分子机制。华大DNBSEQ™转录组测序产品，近年拿下CNS主刊大满贯，更助力科研成果登上Science封面。

今年以来，华大转录组测技术已经被广泛运用在肿瘤相关机制探究、人类的复杂疾病和临床应用到动植物基础机制等各个领域，并且高质量成果产出持续不断。

复杂疾病与临床应用篇

截止今年12月，基于RNA测序技术，2022年，华大合作客户发表的复杂疾病与临床应用研究相关文章已达90+篇，包括Cell、European Respiratory Journal、Annals of the Rheumatic Diseases、Nature Communications、Asian Journal of Psychiatry、Molecular Psychiatry、Proceedings of the National Academy of Sciences、Basic Research in Cardiology在内的IF超6分以上文章达52篇，累计影响因子超561.05分，研究内容涉及多种疾病，包括类风湿关节炎、严重感染、COVID-19感染、糖尿病等。

转录组测序文章-复杂疾病与临床应用领域

今天，将从复杂疾病与临床应用方向为大家介绍相关文章。

经典案例1

类风湿关节炎

文章题目：PU.1 promotes development of rheumatoid arthritis via repressing FLT3 in macrophages and fibroblast-like synoviocytes

发表期刊：Annals of the Rheumatic Diseases

影响因子：27.973

发表单位：安徽医科大学、安徽中医药大学、中国科学技术大学附属第一医院

研究概述：

该研究首次报道了PU.1在类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）中的具体作用和潜在机制，利用转录组技术挖掘其中关键基因表达情况，证明了PU.1可通过直接靶向巨噬细胞和FLS中的FMS样酪氨酸激酶3促进关节炎的发生发展。该研究为RA的治疗提供了新的思路和潜在的治疗靶标。

研究成果：

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性炎症性和破坏性关节疾病，其特征在于滑膜增生和不同细胞类型浸润到关节滑膜中。PU.1是E26转化特异性转录因子家族的成员，对多种骨髓细胞的分化和功能至关重要。以前对PU.1的研究主要集中在与免疫系统相关的癌症上，本研究重点关注PU.1在RA中的具体作用和潜在机制。

免疫组织化学（IHC）和western blotting结果显示，对比于健康供体和骨关节炎（OA）患者，RA患者关节滑膜中PU.1上调，并且PU.1在 RA 关节的滑膜中与巨噬细胞和成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）共表达，表明 PU.1可能在RA的这两种类型的细胞中发挥促炎作用。小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）模型的关节滑膜中PU.1的表达水平也较高。此外，FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）表达模式与 RA 滑膜中PU.1的表达模式相反，这些结果表明，PU.1和FLT3可能在巨噬细胞和FLS中调节RA的发病机制。

该研究使用PU.1敲低小鼠（UREΔ小鼠）研究PU.1在关节炎的发病机制，建立PU.1敲低的胶原诱导关节炎（CAIA）小鼠模型。与野生型小鼠模型相比，UREΔ小鼠的关节炎指数和关节肿胀数明显低于野生型小鼠，滑膜增生程度远低于野生型小鼠。转录组数据显示PU.1的敲低对于外周血单核细胞PBMC的影响表现在各种免疫细胞（如T细胞、B细胞和巨噬细胞）和一些相关的免疫通路受到显著影响。综上的结果表明 PU.1敲低小鼠表现出症状缓解，并且CAIA小鼠中的巨噬细胞和FLS倾向于表现出抗炎表型。

FLT3突变会增加包括RA在内的自身免疫性疾病的风险。基于PU.1和FLT3之间的负相关性，研究人员推断PU.1在RA中抑制FLT3。后续研究证明了在CAIA模型中巨噬细胞FLT3和FLS的内源性表达显著增加，另外PU.1过表达质粒的作用下，FLT3启动子的转录活性明显降低。

为了进一步研究FLT3在RA中的作用，研究人员使用FLT3-ITD小鼠构建了CAIA模型。由于FLT3基因突变，FLT3-ITD小鼠中的FLT3基因被过度激活。与野生型同窝小鼠的CAIA模型相比，FLT3-ITD小鼠的CAIA 模型具有较低的爪肿胀数和关节炎指数。其他病理学和细胞学水平上的指标也都显示表明FLT3是一种抗炎因子，并且FLT3激活可以预防关节炎的发病机。

体外实验表明，PU.1敲低抑制了小鼠巨噬细胞系RAW264.7的炎症特征，转录组结果表明 PU.1敲低调节了RA-FLS相关炎症。此外，炎症细胞因子的增殖、迁移和表达均在PU.1敲低 RA-FLS中下调。FLT3介导的敲低与PU.1敲低具有相反的作用，PU.1抑制剂显著抑制了CAIA小鼠的关节炎进展。

图1 PU.1可能抑制RA患者中FLT3的转录

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类风湿性关节炎是全球发病率最高、影响最广泛的自身免疫性疾病。其主要发病机制与巨噬细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞等多种免疫细胞的异常活化密切相关。本研究首次报道了 PU.1-FLT3轴通过同时影响多个细胞参与RA的发展。多种关节炎模型的应用及RA患者关节滑膜来源原代细胞的相关实验证实PU.1是促进该病发展的关键转录因子，并进行了一系列实验以确定FLT3是否是PU.1靶基因，并介导RA中PU.1的功能。总之，PU.1-FLT3轴是一种促炎通路，可能为RA的治疗提供潜在靶点。

典型案例2

严重感染导致的免疫抑制

文章题目：IL-33 induces thymic involution-associated naive T cell aging and impairs host control of severe infection

发表期刊：Nature Communications

影响因子：17.694

发表单位：南京医科大学、南京医科大学附属南京市第一医院、南京医科大学附属儿童医院、浙江大学医学院免疫学研究所、安徽医科大学等

研究概述：

严重感染通常会导致免疫抑制，从而导致病原体清除受损，人和动物继发感染增加。然而这其中确切的机制知之甚少，该研究通过血吸虫病或脓毒症小鼠疾病模型，发现IL-33通过诱导胸腺退化相关的初始T细胞功能障碍和衰老相关基因的异常表达而导致免疫抑制。并且，该研究揭示了靶向IL-33或ST2是恢复T细胞免疫以更好地控制严重感染的有前途的策略。

研究成果：

为了研究严重感染对宿主初始CD4+T细胞的影响，作者利用血吸虫感染，通过分离从未感染的小鼠和血吸虫感染的小鼠脾脏的初始CD4+T细胞，并进行转录组分析。差异基因分析表明细胞损伤增加，并且严重感染会在CD4+T细胞中诱导衰老。

由于胸腺退化是T细胞衰老的主要标志，因此，研究团队探究了胸腺退化是否导致严重感染期间初始T细胞衰老相关的功能障碍，结果显示，感染后的5-6周，鼠的胸腺大小、重量和胸腺细胞数量显著减少，并伴有T细胞异常发育、CD5表达减少和幼稚T细胞增殖减少等现象。抗血吸虫治疗7周后，小鼠胸腺各方面指标逐渐恢复正常。以上都说明了T细胞衰老相关功能障碍与严重血吸虫感染期间的胸腺退化有关。

大量证据表明，Alarmin IL-33是由血吸虫病和败血症等严重传染病中炎症受损的组织产生的。实验过程中观察到在感染小鼠的胸腺中，全长IL-33的水平显著上升，这可能是由于裂解的IL-33水平低或胸腺在感染期间胸腺缺乏IL-33的裂解蛋白酶。另外，在上述提到的抗血吸虫治疗7周后的小鼠当中，IL-33积累减少。并且IL-33缺陷小鼠表现出正常的胸腺形态和细胞结构和胸腺细胞发育。以上结果都表明IL-33在严重感染期间导致胸腺退化。

接下来，研究人员将ST2充足或缺陷的胸腺移植到用IL-33处理或感染血吸虫的野生型小鼠中，IL-33受体ST2缺陷的胸腺移植恢复了经IL-33处理或血吸虫感染的小鼠的T细胞增殖活性，伴随着胸腺、脾脏和血液中初始T细胞上CD5表达水平的增加。表明IL-33介导的胸腺退化会在严重感染期间损害宿主T细胞对病原体的免疫反应。

鉴于胸腺上皮细胞（TEC）功能或区室的异常是胸腺退化的主要原因，作者进一步进行了体外实验，研究IL-33是否对TEC功能或区室有影响。转录组分析表明，IL-33改变了TEC功能相关基因的表达，改变了其功能。另外，IL-33破坏了mTEC/cTEC区室，导致胸腺退化。进一步研究发现，IL-33导致的mTECs的异常积累和随后的胸腺退化，与胸腺细胞无关，TEC异常分化为mTEC来改变mTEC/cTEC，从而扰乱TEC区室。

考虑到mTEC的异质性（由不同亚群组成），研究团队结合转录组数据发现，在IL-33处理4天的FTOC胸腺TEC中，mTEC-IV的特异性基因普遍上调，而其他亚群没有显著性变化。进一步检测了转录因子Pou2f3的表达水平，发现用IL-33处理的TEC中Pou2f3表达显著增加，以上结果都表明IL-33诱导的mTEC IV细胞的过度生成通过改变mTEC/cTEC的比例和随后的严重感染期间胸腺退化介导的T细胞老化来促进TEC腔隙的破坏。

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由于T细胞老化，发生严重感染的宿主免疫系统可能会丧失有效免疫反应，从而失去破坏或抑制病原体的能力。虽然T细胞老化是严重感染的一个共同特征，但这一过程的潜在机制尚不完全清楚。该研究通过体内和体外实验，结合转录组测序分析等技术，证明了IL-33导致胸腺退化介导的初始T细胞老化并损害宿主控制严重感染的能力。进一步机制研究表明，IL-33会扰乱mTEC/cTEC区室，并通过Pou2f3依赖性方式诱导mTEC IV的过度生成而导致胸腺退化。

典型案例3

新型冠状病毒，转录组表征

文章题目：Transcriptomic clustering of critically ill COVID-19 patients

发表期刊：EUR resp journal

影响因子：33.795

发表单位：Instituto de Investigación Sanitaria del Principado de Asturias、Centro de Investigación Biomédica en Red (CIBER)-Enfermedades respiratorias、Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias

研究概述：

通过对56名重症COVID-19患者外周血进行转录组测序并使用无监督算法进行聚类，该研究评估了基因表达、循环microRNA（c-miRNA）和亚组间临床数据的差异，确定了干扰素相关基因或免疫检查点基因的表达特征，并在两个外部验证队列中进行验证。

研究成果：

研究团队对56名重症COVID-19患者外周血进行转录组测序，利用1,727个基因进行层次聚类，将样本分为两个相互排斥的组CTP1和CTP2。然后评估了两组间基因表达的总体差异，有趣的是，9,700个差异表达基因中，大多数在CTP2中下调 。使用GSEA鉴定涉及这些差异表达基因的分子途径后确定了110个在簇之间具有显著差异的生物过程，确定了与干扰素介导的反应和淋巴细胞活化相关的几个类别。CTP1中的患者显示出多种干扰素基因的富集， 而CTP2富含参与B细胞受体信号转导的基因和调节性 T 细胞分化的基因。

进一步研究发现，CTP1和CTP2对干扰素通路的激活存在差异，CTP1表现出效应子与IFN蛋白之间存在强烈的正相关性，而CTP2并非如此。并且，CTP1和CTP2具有不同的循环淋巴细胞特征：CTP1的患者粒细胞比例较高，淋巴细胞比例较低，单核细胞或NK细胞无差异。

为了进一步识别与观察到的RNA表达和免疫细胞群变化相关的c-miRNA，研究者通过miRNA测序筛选与差异表达mRNA具有靶向关系并且参与体液和细胞免疫调节的miRNA（29个miRNA和151个基因）进行分析，发现miR-145a-5p和miR-181-5p的表达在CTP2中显著降低。

并且，不同亚组对于类固醇治疗也表现出不同的效果，类固醇可以改变两亚组的基因表达情况，但CTP1和CTP2表现出不同的反应途径：类固醇仅在来自CTP1组的患者中下调T细胞和B细胞活化以及IL产生并激活JAK-STAT信号。相反，CTP2的患者类固醇治疗仅与B细胞活化有关。

并使用两个公开可用的数据集，分别包含来自严重和危重COVID-19患者的50和60个转录组数据进行外部队列验证，得到相似结果。

图2 COVID-19转录组簇（CTP）之间的差异表达基因

由SARS-CoV-2引起的感染具有不同的严重程度，从无症状到急性呼吸窘迫综合征（ARDS）危及生命的重症病例，并且ARDS患者表现出不同的临床特征或对严重疾病的全身反应，全血RNA测序后的转录组学分析可能有助于识别具有不同潜在发病机制的危重患者，并设计特定的个性化治疗方案。

RNA测序技术已经广泛应用，从肿瘤相关机制探究、人类的复杂疾病和临床应用到动植物基础机制研究，都可以结合RNA测序技术进行。

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责任编辑：kj005