文章转自博格隆

在抗体纯化过程中，聚集体的去除一直是个让人头疼的问题，聚集体的存在会严重影响产品质量，增加免疫原性风险。作为抗体纯化工艺中最常用的捕获步骤，Protein A亲和层析在抗体捕获方面具有高效性，能够有效去除宿主细胞蛋白（HCP）和DNA等工艺相关杂质。然而，在去除抗体聚集体方面，Protein A亲和层析却存在一定局限。聚集体通常比单体结合更紧密，即便通过调整洗脱pH值，仍难以实现良好的分离。因此，去除聚集体往往依赖于后续的中度纯化和精细纯化步骤，而较高含量的聚集体可能会对后续纯化工艺带来较大挑战。今天我们来聊聊一篇文献中介绍的新策略，助力您在Protein A亲和层析纯化过程中更有效地去除抗体聚集体。

聚乙二醇（PEG）+氯化钙/氯化钠组合

研究团队开发了一种创新方法，显著提升了Protein A亲和层析去除聚集体的效果。该方法在洗涤和洗脱缓冲液中加入聚乙二醇（PEG）和氯化钙/氯化钠组合，通过优化添加浓度，实现了单体和聚集体的几乎完全分离。

原理解析：

1.PEG对Protein A洗脱峰形的影响

在本研究中，研究者尝试通过在洗脱缓冲液中加入不同浓度的PEG（1.5%、3%、5%和10%），以观察PEG对Protein A亲和层析洗脱曲线的影响。PEG作为一种广泛应用于层析的添加剂，通常可以提高单体和聚集体在羟基磷灰石、离子交换和多模式层析柱上的分辨率。这是因为PEG能够增强蛋白质在这些层析柱上的保留，且这种效应随着蛋白分子大小的增加而增强。然而，在Protein A亲和层析柱上，添加高达10%的PEG并未能改善单体和聚集体的分辨率，反而仅仅使目标抗体的保留时间略有增加，洗脱峰变得更尖锐。这一发现解释了为什么此前文献中没有报道在Protein A层析中使用PEG去除聚集体的方法。

2.氯化钙对Protein A洗脱峰形的影响

在另一项研究中，研究者发现，在Protein A亲和层析洗脱缓冲液中加入500 mM离液盐（如氯化钙和氯化镁）可以显著提高异源二聚体和同源二聚体在Protein A亲和层析柱上的分辨率，并使这两类抗体在较高pH条件下洗脱。研究者认为，这些离液盐通过改变抗体与Protein A配基之间的疏水作用，从而提高了填料的选择性。基于这一研究，本文进一步探讨了氯化钙在去除聚集体中的潜在应用。研究中比较了不同浓度氯化钙（250 mM、500 mM、750 mM和1 M）对Protein A亲和层析洗脱峰形的影响，结果显示，氯化钙的确能够在一定程度上改善单体和聚集体的分辨率，且500 mM氯化钙效果最佳。

操作建议：

研究表明，单纯使用PEG作为添加剂并不能有效改善Protein A亲和层析柱中抗体单体和聚集体的分离效果。而氯化钙作为添加剂，能通过调整疏水作用提高分辨率，尤其在去除抗体聚集体方面具有较大潜力。

在Protein A亲和层析层析捕获阶段，可尝试在洗脱缓冲液中加入氯化钠或氯化钙，同时配合5% PEG，以改善聚集体去除效果。

需根据抗体特性和聚集体含量，调整盐和PEG的浓度，推荐先进行小试探究。

虽然氯化钙对分辨率有正面作用，但也可能对蛋白活性造成一定影响，需在实验中进行条件筛选和参数优化，进行综合评估。

可优化参数：

PEG浓度范围：e.g. 1.5%、3%、5%、10%

氯化钙浓度范围：e.g. 250 mM、500 mM、750 mM、1 M

氯化钠浓度范围：e.g. 250 mM、500 mM、600 mM、750 mM

在本文案例中，以500 mM氯化钙或750mM氯化钠和5% PEG组合效果最佳，分离效果显著提升。

方法优势：

显著提升去除效果：

通过向洗脱缓冲液中添加500 mM氯化钙和5% PEG，洗脱液中的聚集体含量从20%降至3-4%。

PEG和氯化钙/氯化钠在合适浓度下表现出显著的协同作用，改善单体与聚集体的分离效果。

提升工艺稳健性：

该方法通过在Protein A亲和层析捕获阶段减少聚集体含量，降低了后续精细纯化的压力，提升整体纯化工艺的稳健性。

小结

通过在Protein A层析洗脱液中添加PEG和氯化钙/氯化钠组合，可以显著提升聚集体去除效果，同时保持抗体高回收率。该方法操作简便，可直接应用于现有工艺中，为抗体纯化工艺的优化提供了新思路。

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参考文献Yuan Zhang et al., A method for improving protein A chromatography's aggregate removal capability, Protein Expression and Purification 158 (2019) 65–73.

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